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[器材和試劑]●PCR試劑和設(shè)備●WinardPCR純化試劑盒（Promega）●定制的DNA引物●VL—NotI引物（5，—GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGCACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAACACCCAACC—3’）●LMB3引物●用于scFv基因文庫(kù)限制性消化的試劑和設(shè)備●已擴(kuò)增的scFv基因文庫(kù)DNA[方法]1．配制4個(gè)50ulPCR反應(yīng)混合液，包含：●去離子水，35．5ul●20×dNTP（每種5mmol/L），2．5u...
[器材和試劑]●去離子水（millipore）●T4DNA連接酶和10×連接酶緩沖液（NEB）●16℃水浴●消化的scFv文庫(kù)DNA●pHENlDNA，用NcoI和NotI消化（100ng／ul）●電感受態(tài)大腸桿菌TGl細(xì)胞（Strataeene）●用于將scFv文庫(kù)電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl株的試劑和設(shè)備[方法]1．配制1個(gè)50ul連接混合液，包含：●10×連接緩沖液，5uI●水，16ul●NcoI和NotI消化的pHENl（100g／ul），20ul●VcoI和NotI消化的...
1．多樣化的噬菌體抗體丈庫(kù)中制備噬菌體抗體。2．根據(jù)廠家說明，對(duì)抗原進(jìn)行生物素化。3．選擇前，在1個(gè)1．5m1微量離心管中．用2％MPBS1m1封閉150ul鏈霉親和素磁珠，室溫1小時(shí)。用磁性試管架將碰珠吸向一側(cè)。棄去緩沖液。4．用2％MPBS封閉3個(gè)1．5m1微量離心管，室溫1小時(shí)；而后，棄去封閉緩沖液。以3個(gè)不同濃度將士物素化抗原（總共3管）與溶于2％MPDS（終濃度）的1m1噬茼體樣品（大約1012c{u／m1）進(jìn)行孵育，室溫振蕩l小時(shí)。對(duì)于*輪選擇，抗原濃度應(yīng)分別為K...
選擇3～5輪后，隨機(jī)挑取克隆加入96孔微量滴定板中并誘導(dǎo)表達(dá)可溶性scFv。然后，在包被有相關(guān)抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的細(xì)菌上清。此過程可以識(shí)別出那些結(jié)合了抗原的scFv。但即便采用上述嚴(yán)謹(jǐn)性選擇后，ELISA陽性克隆中僅有部分克隆的親和力比野生型高。ELISA信號(hào)強(qiáng)度不能很好地顯示哪個(gè)克隆具有較低的Ka值，而且更為普遍的是它與scFv表達(dá)水平相關(guān)。因此，這就需要一種篩選ELISA陽性克隆的技術(shù)，能識(shí)別出具有較低Ka值的克隆。競(jìng)爭(zhēng)性或抑制性...
A液（80ml）：1％氯化金，lml；雙重蒸餾水，79ml。B液（20m1）：1％檸檬酸鈉，4ml；1％單寧酸，0.lml；雙重蒸餾水，15．8ml。25mmol/LK2C03，0．1ml；將上述A液加熱到60℃，然后將B液快速加入到A液中，繼續(xù)攪拌，在極短的時(shí)間內(nèi)加熱到煮沸（大約10min），此時(shí)顏色由黑一藍(lán)一亮紅（近似紅葡萄酒顏色）變化。pH調(diào)到所需要求（根據(jù)所標(biāo)記蛋白質(zhì)種類的不同，所需的pH也不一樣）。上述用量合成的膠體金為10nm，根據(jù)所加入鞣酸（或稱單寧酸）量的不同...
乙醇—超聲波還原法（Baigent和Muller，1980）（1）取1％AuCl3·HCl水溶液lml加入100ml雙重蒸餾水。（2）用0．2m01/LK2C03調(diào)pH至7．2，再加入lml無水乙醇。（3）用20KC、135W超聲波探頭浸入溶液內(nèi)進(jìn)行超聲振蕩，此法制備的顆粒為6～10nm。硼氫化鈉還原法（Tschopp等，1982）（1）取0．6ml1％氯化金水溶液，加入40ml預(yù)冷（4℃）雙蒸餾水。（2）再加入0．2mol/LK2C030．2ml。（3）邊攪拌邊加入新鮮配制...
『安全』是進(jìn)行任何實(shí)驗(yàn)zui重要的考量，若不留意，經(jīng)常會(huì)造成*的遺憾，因此，請(qǐng)遵守以下各項(xiàng)規(guī)定：1.請(qǐng)事先勘查緊急沖洗站、洗眼臺(tái)及滅火器的位置。2.請(qǐng)避免穿著涼鞋或拖鞋（腳趾不要裸露），并請(qǐng)穿著實(shí)驗(yàn)衣。留長(zhǎng)發(fā)者，在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前將頭發(fā)束好。3.在實(shí)驗(yàn)室請(qǐng)勿吸煙、化妝、嚼口香糖、吃東西、喝飲料。食物不可存放于實(shí)驗(yàn)室的冰箱中。4.實(shí)驗(yàn)前后請(qǐng)將工作區(qū)域清理擦拭干凈，實(shí)驗(yàn)中打翻任何藥品試劑時(shí)，要隨時(shí)清理；離開實(shí)驗(yàn)室前請(qǐng)記得洗手。5.使用刻度吸管時(shí)，切勿用嘴吸取，請(qǐng)用安全吸球或吸管唧筒。6...
微量移液器（micropipet）是進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)或分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的*工具，然而使用方法的正確與否，以及微量移液器的準(zhǔn)確性，都直接影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性，故請(qǐng)對(duì)你持有之微量移液器作深入的認(rèn)識(shí)。本實(shí)驗(yàn)室所使用的微量移液器為GilsonPipetmanP系列，包括P1000,P200,P20等。以下使用方法及注意事項(xiàng)，部份取材自原廠所附說明書，請(qǐng)?jiān)斪x之后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1）請(qǐng)參照?qǐng)D1.1，認(rèn)識(shí)微量移液器每一部份組件之位置及名稱。2）將D（ejector）取下，C（connectingn...
當(dāng)前位置：
